Trichoderma

         ลักษณะโดยทั่วไปของเชื้อรา Trichoderma
         เชื้อราไตรโคเดอร์มา (Trichoderma ) เป็นจุลินทรีย์ชนิดหนึ่งที่มีประโยชน์ จัดเป็น soil saprophyte และเป็น mycoparasite โดยใช้เส้นใยขดเป็นวงรอบๆ เส้นใยเชื้อราสาเหตุโรคพืช จากนั้นเข้าไปเจริญในเส้นใยของเชื้อราสาเหตุโรคพืชได้โดยการย่อยผนังเซลล์ แล้วใช้อาหารจากเชื้อราสาเหตุโรคพืช เชื้อราไตรโคเดอร์มาเจริญได้ดีในดินที่มีความชื้นแต่ไม่แฉะ สามารถแยกเชื้อบริสุทธิ์จากดินธรรมชาติได้ง่าย ขยายพันธุ์โดยการสร้างสปอร์ นำมาเพาะเลี้ยงจะเห็นเส้นใยและสปอร์สีเขียว อยู่รวมกันเป็นกลุ่มก้อน Bassett (1984) ได้อธิบายลักษณะของเชื้อราชนิดนี้ไว้ว่า เป็นเชื้อราที่เจริญรวดเร็วบนอาหารหลายชนิด สร้าง conidiophore ที่แตกกิ่งก้านสาขา โดยที่ปลายconidiophore มีโครงสร้างกำเนิด conidium หรือ spore เรียกว่า phialide รูปร่างคล้ายลูกโบว์ลิ่งconidium ซึ่งเกิดจากปลาย phialide จะรวมกันเป็นกลุ่มก้อน (slime head) เห็นเป็นสีเขียวหรือใส(hyaline) ส่วนระยะสมบูรณ์เพศ หรือ teleomoph ของเชื้อรา Trichoderma คือเชื้อราในจีนัส Hypocrea หรือจีนัสอื่นๆ ที่ใกล้เคียงกัน สามารถพบได้ทั่วไปในดินที่มีความอุดมสมบูรณ์และมีอินทรีย์วัตถุอาศัยเศษซากพืชและสัตว์เป็นแหล่งอาหาร (กณิษฐา , 2548) พบว่าในดินที่ปราศจากแหล่งอาหาร เชื้อราชนิดนี้สามารถอยู่รอดได้นานกว่า 130 วัน เชื้อรา Trichoderma จัดเป็นเชื้อที่มีประสิทธิภาพสูงในการเจริญแข่งขันกับเชื้อราสาเหตุโรคพืช เนื่องจากมีการเจริญเติบโตและเพิ่มปริมาณได้อย่างรวดเร็ว และสามารถมีชีวิตรอดอยู่ได้ในที่มีอุณหภูมิเย็นจัดประมาณ 10-12 องศาเซลเซียส (Johnson et al., 1987) ราสกุลนี้มีรายงานการจัดจำแนกไว้หลายชนิด (Bilai, 1963) โดยRifai (1969) ได้จัดจำแนกเชื้อรา Trichoderma spp. ออกเป็น 9 ชนิด T. piluliferum,T. polysporum, T. aureoviride, T. hamatum, T. koningii, T. harzianum, T. longibrachiatum,T. pseudokoningii และ T. viride   Colony เชื้อรา Trichoderma spp. มีการสร้างเส้นใยเจริญเติบโตเร็ว เริ่มแรกโคโลนีมีผิวหน้าเรียบ ไม่มีสี (translucent) หรือสีขาว (watery white) ต่อมาโคโลนีมีลักษณะเป็นแบบปุยฝ้ายฟูอย่างหลวม ๆ ( loosely floccose) หรือเป็นกระจุกหนาแน่น (compactly tuft) หรือมีลักษณะทั้งสองแบบในโคโลนีเดียวกัน หรือมีลักษณะอยู่ระหว่างทั้ง 2 แบบ การเกาะกันเป็นกระจุกของโคโลนีมีส่วนเกี่ยวข้องกับโครงสร้างของก้านชูสปอร์ (conidiophore) (นุชนารถ, 2535)การสร้างสปอร์ของเชื้อรา Trichoderma spp. ที่สำคัญคือบริเวณที่สร้างสปอร์มีลักษณะเป็นวงรอบหรือเป็นวงแหวน (ring-like zone) ซึ่งเกิดจากอิทธิพลของแสง Gutter (1957) อ้างโดยลาวัลย์และคณะ (2540) และเมื่อโคโลนีมีอายุมากขึ้นจะมีการสร้าง conidiophore ขึ้นมาใหม่อีกบริเวณรอบนอกที่สร้างสปอร์ทำให้เห็นการเกิดวงรอบ หรือ zonation ไม่ชัดเจนสำหรับใน isolateที่โคโลนีเป็นแบบปุยฝ้าย (floccose) การสร้าง zonation สามารถสังเกตได้ในขณะที่เชื้อยังมีอายุน้อยเท่านั้น สีของโคโลนีส่วนใหญ่เกิดมาจากการสร้างสีของสปอร์ (phialospore) โดยปกติT. viride มีโคโลนีสีเขียวเข้ม (dark green) แต่บางครั้งเมื่อมีหลายๆ ชนิด (species) ขึ้นอยู่ร่วมกันอาจจะแสดงสีที่แตกต่างออกไปอย่างชัดเจน ตั้งแต่สีเหลืองไปจนถึงสีเขียวอ่อน และ T. polysporum โคโลนีมีสีขาวเนื่องจาก phialospore ไม่มีสี นอกจากสีของสปอร์ที่มีผลต่อสีของโคโลนีแล้ว ยังมีปัจจัยอื่นอีกคือ

           1. ปริมาณสปอร์ที่สร้างขึ้น ทำให้โคโลนีเข้มขึ้นหรืออ่อนลง
           2. สร้างผลึกสี หรือปล่อยสีออกมา ทำให้สีของอาหารเลี้ยงเชื้อเปลี่ยนไป
           3. ชนิดและ pH ของอาหารเลี้ยงเชื้อมีผลต่อสีของโคโลนี
           4. การสร้างเส้นใยที่ยืดตัวออกและเป็นหมัน (sterile hyphal elongation) เหนือกระจุกของ conidiophore ของ T. hamatum ทำให้โคโลนีมีสีขาวหรือสีเทาเขียว (greyish-green)
Mycelium ไม่มีสี มีผนังกั้นระหว่างเซลล์ มีการแตกกิ่งก้านมากมาย ผนังเส้นใยเรียบ(Rifai,1969)
Chlamydospore เป็นสปอร์ที่มีผนังหนา สร้างขึ้นเพื่อความอยู่รอด ส่วนใหญ่จะสร้างระหว่างเส้นใย ไม่ค่อยพบที่สร้างปลายเส้นใย รูปร่างกลม (globose) เป็นส่วนใหญ่ ส่วนรูปกระสวย (ellipsoid) ไม่มีสี และผนังเรียบพบน้อยมาก (Rifai,1969)
Conidiophore ก้านชูสปอร์ของเชื้อรา Trichoderma มีการแตกกิ่งก้านหลายแบบและการสร้างสลับซับซ้อนกันมาก มองดูโครงสร้างรอบนอกเป็นรูปกรวย (conical) หรือแบบปิรามิด(pyramid) ตัวอย่างเช่น เชื้อรา T. hamatum และ T. polysporum มีก้าน conidiophore ยาว แตกกิ่งก้านด้านข้างสั้นและหนา มีลักษณะเฉพาะคือ สร้างเส้นใยที่ยืดตัวออกเป็นหมัน เป็นเส้นยาวคล้ายแส้ เป็นส่วนที่ไม่สร้างสปอร์อยู่ปลายก้านของ conidiophore ส่วนเชื้อรา T. longibrachiatum มีเส้นแกนกลางของก้าน conidiophore ค่อนข้างยาว และแตกกิ่งก้านสั้น ส่วนเชื้อรา T. hamatum และ T. polysporum ที่สร้าง conidiophore มีการแตกกิ่งก้านน้อยและสลับกันไป สำหรับเชื้อราT. viride และ T. koningii สร้าง conidiophore ที่มีการแตกกิ่งก้านด้านข้างออกมาจากจุดเดียวกันเหมือนกับพวกเชื้อรา Verticillium (นุชนารถ, 2535)
Phialide เป็นก้านสปอร์ที่อยู่ปลายสุด ให้กำเนิดสปอร์ส่วนมากจะมีรูปร่างคล้ายขวดรูปชมพู่ (flask) หรือลูกพินโบว์ลิ่งที่ฐานจะแคบกว่าตรงกลางเล็กน้อย และค่อยๆ เรียวไปยังส่วนปลาย ซึ่งตรงปลายจะเป็นรูปกรวยแคบๆ (conical neck) หรือใกล้จะเป็นทรงกระบอก(subcylindrical terminal phialide) โดยทั่วไป phialide จะแตกออกมาจากจุดกำเนิดเป็นมุมกว้างและปลายโค้งงอ ทำให้มองด้านข้างเหมือนเขาสัตว์ (horn-shape) และอาจเกิดขึ้นบนกิ่งก้านของconidiophore ที่แตกด้านข้าง ลักษณะเรียงกันของ phialide เป็นวงรอบไม่สม่ำเสมอ มีจำนวนถึง5 อัน เกิดที่ปลายก้านของ conidiophore ซึ่งเกิดจากเซลล์ที่ให้กำเนิด หรือเกิดตลอดกิ่งก้านแบบเดี่ยวๆ และสลับกันไป หรือเกิดตรงข้ามเป็นคู่ๆ แต่ส่วนใหญ่อันที่อยู่ปลายสุดมักเกิดเดี่ยวๆ และค่อนข้างยาวกว่าอันที่อยู่ข้างล่าง (นุชนารถ, 2535)
Phialospore เกิดเดี่ยวๆ และเกาะกลุ่มกันเป็นก้อนกลม (globose) หรือค่อนข้างกลม(subglobose) ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางต่ำกว่า 15 μ อยู่บนปลาย phialide ข้างเคียงอาจรวมกันเป็นก้อน (conidial head) ที่ใหญ่ขึ้น ผนังของสปอร์เรียบ หรือบางครั้งพบขรุขระเล็กน้อย ไม่มีสี(hyaline) หรือสีเหลือง (yellowish-green) จนถึงสีเขียวดำเข้ม (dark green) รูปร่างค้อนข้างกลม(subglobose) รูปไข่หัวกลับและสั้น (short obovoid) หรือรูปไข่หัวกลับ (obovoid), รูปกระสวย(ellipsoid) หรือรูปทรงกระบอกเรียวแบบกระสวย (elliptic-cylindrical) จนถึงส่วนใหญ่เป็นรูปสี่เหลี่ยมผืนผ้า (oblong) บางครั้งที่ปลายฐานสปอร์มีลักษณะเป็นมุมเหลี่ยม (angular) ปลายฐานตัดตรง (truncate base) ชัดเจน ในขณะที่สปอร์ที่ยังอ่อนอยู่พบหยดน้ำมันภายในแล้วหายไปเมื่อเจริญเติบโตเต็มที่

           การแยกจุลินทรีย์ปฎิปักษ์ Trichoderma spp.
ตักดิน 1 กรัม ผสมในน้ำกลั่นนึ่งฆ่าเชื่อ 9 มิลลิลิตร เจือจางที่ 10-3, 10-4 และ 10-5 หยดดินแขวนลอยบนจานเลี้ยงเชื้อที่มีอาหาร TSM (Thornton’s standardized medium) ปริมาตร 20ไมโครลิตร เกลี่ยด้วยแท่งแก้ว บ่มเลี้ยงไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 วัน เลือกเก็บโคโลนีของ Trichoderma spp. ซึ่งมีโคโลนีสีเขียว ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 0.5-1.5 เซนติเมตร เพื่อใช้ในการศึกษาต่อไป

            การผลิตขยายเชื้อราไตรโคเดอร์ม่า
            การผลิตขยายเชื้อราไตรโคเดอร์ม่าสามารถผลิตขยายได้จากอาหารหลายชนิด เช่น เมล็ดข้าวฟ่าง ข้าวสุกหรือบนอาหารวุ้น (PDA) แต่การผลิตขยายบนเมล็ดข้าวฟ่าง และอาหารวุ้นค่อนข้างยุ่งยากไม่สะดวกต่อการส่งเสริมให้เกษตรกรนาไปผลิตขยายใช้เอง แต่ถ้าผลิตจากข้าวสุกเกษตรกรสามารถผลิตได้ และไม่ต้องใช้วัสดุอุปกรณ์ราคาแพงแต่ยังคงประสิทธิภาพในการควบคุมเชื้อราสาเหตุโรคพืชได้ ในที่นี้ขอกล่าวถึงการผลิตขยายเชื้อราไตรโคเดอร์ม่าโดยใช้ข้าวสุกเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อ
การผลิตขยายเชื้อราไตรโคเดอร์ม่าบนข้าวสุก

           วัสดุอุปกรณ์
1. หม้อหุงข้าวไฟฟ้าอัตโนมัติ 6. เข็มเย็บผ้า หรือเข็มหมุด
2. แก้วน้า หรือถ้วยตวง 7. ข้าวสาร หรือปลายข้าว
3. ทัพพีตักข้าว 8. หัวเชื้อราไตรโคเดอร์ม่าชนิดผงแห้ง
4. ถุงพลาสติกใสทนร้อน ขนาด 8 X 12 นิ้ว 9. เครื่องชั่ง
5. ยางวง

           ขั้นตอนการผลิตขยาย
1. หุงข้าวด้วยหม้อหุงข้าวไฟฟ้าอัตโนมัติ โดย ใช้ปลายข้าว 3 ส่วน + น้า 2 ส่วน ถ้าข้าวนิ่มเกินไปให้ใช้ปลายข้าว 2 ส่วน + น้า 1 ส่วน เมื่อข้าวสุก ใช้ทัพพีซุยข้าวให้ทั่ว

2. ตักข้าวสุกขณะร้อน ใส่ถุงพลาสติกทนร้อนขนาด 8x12นิ้ว(เพื่อป้องกันจุลินทรีย์จากอากาศเข้าไปปนเปื้อนในถุงข้าว)
3. ตักข้าวสุกใส่ถุงละ 250 กรัม
4. กดข้าวในถุงเบาๆ ให้แบนเพื่อไล่อากาศออกจากถุง โดยให้ถุงพลาสติกแนบกับข้าวเพื่อลดการเกิดหยดน้า รอจนข้าวอุ่นหรือเกือบเย็น จึงนาไปใส่หัวเชื้อ
5. เลือกบริเวณที่ลมสงบ(เพื่อป้องกันการปนเปื้อนของ จุลินทรีย์ในอากาศ) แล้วใส่หัวเชื้อลงในถุงข้าวถุงละ 1 - 1 . 5 กรัม (2-3 เหยาะ)
6. รัดยางตรงปากถุงให้แน่น แล้วเขย่าหรือบีบข้าวเบา ๆ เพื่อให้หัวเชื้อกระจายให้ทั่วถุง
7. รวบถุงให้บริเวณปากถุงพอง แล้วใช้เข็มแทงรอบ ๆ บริเวณที่รัดยาง ประมาณ 20 -30 ครั้ง
8. กดข้าวในถุงให้แผ่กระจายไม่ซ้อนทับกัน ดึงบริเวณกลางถุงขึ้น ไม่ให้พลาสติกแนบติดกับข้าว เพื่อให้มีช่องว่างในถุง
9. วางถุงข้าวเพื่อบ่มเชื้อในห้องที่ปลอดจากมด ไร และสัตว์ต่าง ๆ เป็นเวลา 2 วัน โดยอากาศไม่ร้อน ไม่ถูกแสงแดด แต่ได้รับแสงสว่าง 6-10 ชั่วโมง / วัน หากแสงไม่พอ ใช้แสงจากหลอดนีออนช่วยได้
10. เมื่อครบ 2 วัน บีบขยาก้อนข้าวที่มีเส้นใยเชื้อเจริญอยู่ให้แตก แล้ววางถุงในที่เดิมดึงถุงให้มีอากาศเข้าอีกครั้งแล้วบ่มในสภาพเดิมต่ออีก 4-5 วัน (อย่าลืมดึงถุงให้โป่ง)
11. เชื้อสดที่ผลิตได้ควรนาไปใช้ทันที หรือเก็บในตู้เย็นช่องธรรมดาไม่เกิน 1 เดือน ก่อนนาไปใช้
การ

           การใช้เชื้อราไตรโคเดอร์ม่า
          1. คลุกเมล็ด อัตราการใช้ เชื้อสด 10 กรัม หรือ 1 ช้อนแกง คลุกกับเมล็ดพันธุ์น้าหนัก 1 กก.โดยตักเชื้อสด 10 กรัมใส่ในถุง แล้วเติมน้าสะอาดเล็กน้อยเพื่อให้คลุกง่ายและเชื้อติดเมล็ดดี การคลุกเมล็ดเพื่อป้องกันการเข้าทาลายของเชื้อโรคที่ติดมากับเมล็ดพันธุ์ และเชื้อโรคที่อาศัยอยู่ในดิน ป้องกันการเกิดเมล็ดเน่า และโรคเน่าระดับดินได้ นอกจากนี้เชื้อราไตรโคเดอร์ม่า (Trichoderma harzianum)) ที่ติดอยู่กับเมล็ดจะเจริญเข้าสู่ระบบรากพืช ช่วยปกป้องระบบรากพืชไม่ให้เชื้อโรคเข้าทาลาย การคลุกเมล็ดด้วยเชื้อราไตรโคเดอร์ม่า(Trichoderma harzianum) มีข้อจากัดบางประการ คือ หลังคลุกเมล็ดแล้วต้องนาไปปลูกทันที ไม่สามารถเก็บไว้ได้นานๆ
          2. ผสมน้าฉีดพ่น อัตราการใช้ เชื้อสด 1 กก. ผสมกับน้า 200 ลิตร ฉีดพ่นในขณะแดดอ่อน หรือเวลาเย็น โดยรดน้าให้ดินชื้นก่อนหรือหลังฉีดพ่น อัตราฉีดพ่น 1 ลิตรต่อพื้นที่ 5-10 ตารางเมตร
          3. ใส่บนดิน การใช้เชื้อสดใส่บนดิน โดยหว่านบนแปลงปลูกพืช รองก้นหลุม หว่านรอบทรงพุ่ม หรือนาไปผสมวัสดุปลูกไม้กระถาง มี 2 ขั้นตอนดังนี้
            3.1 ขั้นตอนที่ 1 ผสมเชื้อสด ตามอัตราส่วน ดังนี้ คือ
1. เชื้อสด 1 กก.
2. ราละเอียด 4 กก.
3. ปุ๋ยหมัก 100 กก.
            3.2 ขั้นตอนที่ 2 นาไปใช้ ดังนี้
1. หว่าน ใช้ส่วนผสมอัตรา 50 – 100 กรัม ต่อ พื้นที่ 1 ตารางเมตร ช่วงการเตรียมดินครั้งสุดท้ายก่อนปลูกพืช หรือหว่านลงในแปลงหลังการปลูกพืช
2. รองก้นหลุม ใช้ส่วนผสมเชื้อสด อัตรา 25 – 50 กรัมต่อหลุม
3. แปลงเพาะกล้า ใช้ส่วนผสม อัตรา 50-100 กรัมต่อพื้นที่ 1 ตารางเมตร
4. ถุงเพาะชา ใช้ส่วนผสม อัตรา 25-50 กรัมต่อ 1 ถุง
5. ไม้ผลไม้ยืนต้น ใช้ส่วนผสม อัตรา 3-5 กก.ต่อ 1 ต้น
6. พืชผัก เช่น พริก มะเขือ ฯลฯ ใช้ส่วนผสม อัตรา 50-100 กรัมต่อ 1 ต้น
7. ผสมวัสดุปลูก ใช้ส่วนผสม 1 ส่วน ผสมกับวัสดุปลูก 4 ส่วน โดยผสมและคลุกเคล้าให้เข้ากันดีก่อนบรรจุลงในภาชนะปลูก

           แนวทางการควบคุมคุณภาพเชื้อราไตรโคเดอร์ม่า
1. ตรวจสอบคุณภาพของเชื้อราไตรโคเดอร์ม่าให้บริสุทธิ์ปราศจากาการปนเปื้อนจากเชื้อราหรือเชื้อแบคทีเรีย หากปนเปื้อนให้คัดแยกออกทันทีทุกครั้งที่ทาการผลิตขยาย
2. ตรวจสอบปริมาณสปอร์ของเชื้อราที่ผลิต
3. จากัดการขยายต่อเชื้อจากหัวเชื้อขยายต่อได้ไม่เกิน 3 รุ่น ( หัวเชื้อบริสุทธิ์จากดิน รุ่นที่ 1 หัวเชื้อบนอาหารวุ้นรุ่นที่ 2 เชื้อสดจากข้าวฟ่าง รุ่นที่ 3 )